大量流行病学研究和临床观察证明无机砷化合物与人类的几种癌症有关,是确认致癌物;但是,大多数动物诱癌实验表明砷不能诱发动物发生肿瘤。因此,砷不是始发致癌剂,而是辅致癌剂或辅癌剂。大多数实验也表明,砷化合物不能诱发基因突变,但可促进UV照射和一些化学致突变剂的致突变作用,因此,砷被认为是辅致突变剂或辅突变剂。砷也是第V主族元素中唯一可致畸的元素。
砷与突变作用
大多数研究指出,三价砷和五价砷在Ames鼠伤寒沙门氏菌/微粒体酶试验中是阴性的(1,2),未能诱发基因突变。砷化合物也不能诱发大肠杆菌色氨酸缺陷型菌株发生突变(3-5)。 Nishioka等曾报告在枯草杆菌重组缺陷测定中砷化合物获得阳性结果(6,7),但Siman采用同样的菌株和方法却获得阴性结果(2)。 最近Nishioka等获得了与前报告截然相反的结果,报道低浓度的亚砷酸钠在E.ColiWP2(UVrA),pKM101回复突变测定中强烈抑制紫外线(UV)照射、4—硝基硅啉—N—氧化物、2—氨基芴及甲基甲烷磺酸酯等的致突变作用,对自发回复突变也有强烈抑制作用(8)。
虽然亚砷酸钠对大肠杆菌没有致突变性,但有辅致突变作用。 Rossmanetal报道,较低浓度的亚砷酸钠能够促进UV照射对大肠杆菌的突变作用,且仅对具切除修复的菌株WP2有辅突变作用,对不能进行嘧啶二聚体切除修复的菌株,例如WP6(polA)和WP2S(UVrA)则无辅突变作用。UV照射不能引起突变的菌株,如WP5(LexA)和WP10(recA),在UV照射后,砷的处理也未能引起和增加突变。砷的这些效应与咖啡因很类似。五价砷化合物(砷酸钠)在同样浓度下未见辅突变作用(4)。
一般认为,砷化合物对人和哺乳动物细胞也没有致突变性,或仅有极弱的致突变作用。最近研究指出,三价和五价砷化合物对小鼠淋巴瘤细胞胸苷激酶基因均没有或仅有微弱的致突变作用(9,10)。我们最近应用PCR和DNA碱基序列分析技术研究发现,亚砷酸钠在极高浓度下才能引起CHO—AS52细胞gpt基因的突变。
亚砷酸钠对人和哺乳类细胞也有辅突变作用。Leeetal和Janetal最近证明,亚砷酸钠强力促进UV照射和烷化剂对哺乳类细胞的染色体断裂和致突变作用(11,12),也可促进DNA交联剂顺铂( )(Cis-Pt( ))、氧化补骨脂素(8-MOP)加长波UV照射(UVA)对中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和人皮肤成纤维细胞的染色体断裂作用和致突变作用(13)。
亚砷酸钠的辅突变作用是复杂的。CHO细胞受UV照射以后,再用亚砷酸钠处理,砷对UV诱发的细胞毒性、染色体畸变(CA)及6—巯基鸟嘌呤抗性突变有协同效应,而对UV诱发的SCE和G毒毛旋花苷抗性突变无协同效应。亚砷酸钠对CA的协同效应随UV照射与砷处理之间间期的延长而减弱(12)。
亚砷酸钠处理细胞的先后不同,其效应可完全不同。 预先用亚砷酸钠处理CHO细胞,然后再用甲基甲烷磺酸酯(MMS)处理,砷可减低MMS诱导的次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)基因突变率,也可减少MMS对细胞分裂和繁殖的抑制作用; 如果CHO细胞先用MMS处理,再用亚砷酸钠处理,砷急剧增高MMS的细胞毒性、染色体断裂、HGPRT基因突变作用,及MMS对细胞分裂和增殖的抑制作用。然而,不论何时处理,砷对MMS诱发SCE的作用均无影响(12)。
2. 砷的致畸变作用
砷是化学元素周期表中第V主族元素中唯一可致畸的元素。Leonard报告对BALB/C雄小鼠腹腔注射亚砷酸钠5mg/Kg体重,6h后与雌小鼠交配,17d后检查胚胎,未见砷引起精细胞改变(14)。 然而,近来的研究指出,连续5d腹腔注射亚砷酸钠(总量为11—23mg/Kg体重)给ICR雄鼠,4—5wk以后,小鼠精子畸形率显著增高,且呈剂量依赖关系(15)。 上述两种完全不同的实验结果,可能与砷的剂量、作用时间及小鼠品系的敏感性等有关。
Sram等用显性致死试验评价了砷对哺乳动物精细胞的遗传危险性(14)。小鼠急性口服亚砷酸钠250mg/Kg体重,显性致死率未见改变。然而,通过慢性砷处理,让雄鼠饮用含亚砷酸钠(10或100mg/L)水8wk,然后与母鼠交配。F1—3代均以同样方式获得。对砷处理的F3代雄鼠,在交配前腹腔注射标准致突变剂TEPA(tris-1-aziridinyl-phos-phineoxide),观察TEPA单用和与砷合用的区别。结果发现,100mg亚砷酸钠/L水和1mgTEPA/Kg体重,在砷处理组F3合用时,畸变率比单用TEPA明显增高。作者认为这是由于砷化合物抑制DNA修复酶的活性,使遗传物质受TEPA损伤后的修复过程受抑,从而造成遗传损伤效应。
砷化合物的致畸作用可能与给药途径、时间和剂量有关。将砷酸钠(20mg/Kg体重)静脉注射给孕期的金色仓鼠,若是在受精后第8d注射,子代可发生露脑畸形(14);若是在胚胎发生关键期的后期注射,可发生的胚胎畸形有:泌尿生殖系统畸形、腭裂、唇裂、无眼畸形及耳畸形(14,16)。 砷还可引起仓鼠肾发育不全。对怀孕第6至第12d的小鼠腹腔注射亚致死剂量的砷酸钠(45mg/Kg体重),在存活的胚胎中可产生各种畸形;但是如果在同一孕期注射砷酸钠(25mg/Kg体重),则未见畸胎诱发。 给孕期的绵羊和鸡饲喂砷酸钠可使子代变小。如果用砷中毒治疗剂BAL预先处理动物,则砷致畸作用减弱。硒也可减轻砷对小鼠精子的致畸效应(15)和对金色田鼠的致畸效应。
高剂量的砷对人可能有致畸作用(14)。 Luegoetal报道一个17岁的孕妇在孕期的最后3个月服用了砷化合物,生下的婴儿仅1.1Kg体重,只活了11个小时,婴儿肝、脑、肾中砷含量均很高(14,16)。
无机砷的致畸作用,表明作为阴离子形式的砷能够通过哺乳类动物的胎盘(14,17)。 对于有机砷化合物,过去曾大量用于孕妇的梅毒病治疗,加之后来的动物实验,均表明有机砷化合物难以通过人、猫和兔等哺乳动物的胎盘,但可以相当高的浓度贮存在胎盘内(16,17)。
3. 砷与癌变
3.1砷致癌的流行病学研究
然而,对人体癌症病因的调查常有一些困难,原因之一是因为所调查的人群往往不只接触一种致癌因子;原因之二是很难找到适当的对照人群。尽管如此,大量流行病学调查证实,通过饮食和呼吸而长期接触砷化合物的人群,皮肤癌、肺癌以及癌前期的皮肤角化病的发病率确实增高了。砷致癌的潜伏期可长达几十年。因此,流行病学研究对所调查人群的吸烟及其它习惯应加以考虑,以便对调查结果进行正确分析和评价。
文献报道,从事砷杀虫剂生产的工人、金矿工人,以及铜、锌等金属冶炼工人,通过呼吸摄入砷,可引起皮肤癌、支气管癌和肺癌,还可引起淋巴瘤和白血病(2,6,21)。 饮用砷污染的水和啤酒可引起肝癌,也可引起肺癌(22)。 用砷制剂治疗疾病还可使支气管癌发病率增高。 用三氧化二砷治疗气喘病可导致Bowen‘s病发生,后者在临床上具有慢性癌前性皮炎和多发性上皮癌的症状(23)。
根据砷中毒地区流行病学研究结果,饮水含砷量高达0.8～2.6mg/L的地区,居民色素沉着、皮肤角质化及皮肤癌发病率增高。在台湾发现,饮水中砷含量越高,皮肤癌的发病率就越高。在阿根廷发现,饮水砷污染后,皮肤癌、肺癌及胃肠癌等的发病率上升(22,23)。 近年来,流行病学研究发现,肺癌发生率与大气砷水平相关(24)。 接触砷的肺癌死亡率与接触砷时工人年龄有关(25)。 也有人报道,接触砷以后,10年内可发展为肺癌,但停止砷的接触以后,随时间的延长,砷的效应逐渐消失,从而认为砷是肿瘤的促进剂而不是始发剂。
3.2砷与癌变的动物实验 砷在流行病学上是确认的人类致癌物,但绝大多数动物实验却不能证明砷的致癌性。在所有对人类致癌的金属和类金属化合物中,砷是唯一未能通过动物致癌实验证实其致癌性的元素(26)。
Hueper和Payne以含三氧化二砷的水(34mg/L)让大鼠和小鼠饮用两年,未见砷对实验动物的任何毒性,也未能诱发肿瘤。 Boutwell(1963)和Milner(1969)发现,砷化合物可减少实验动物的肿瘤发生率(14,16)。 将含有CuSO4、Ca(OH)2及Ca3(AsO4)2的杀虫剂混合物,一次性气管注入,15只大鼠中9只发生肺癌,但对杀虫剂中每组分未作单独实验,所以不能肯定砷的致癌性(27)。 将含砷的云南锡矿粉注入大鼠气管,三年内41只大鼠有6只发生肺癌,而对照组18只大鼠均未发生肿瘤。由于在锡矿粉中除含砷约2%或16%外,尚含铁54%或26%,铅0.1%或16%,作者未能排除铁与铅在致癌中的作用(28)。
近年来,在砷致癌的动物实验中,有的也获得了阳性结果,但这些结果有待验证和扩展。 有人报道,将三氧化二砷注入雌叙利亚地鼠,每wk1次,共4个月,30只地鼠在其一生中有5只发生肺癌,而35只对照地鼠均未发生肿瘤(29)。从此,作者认为三氧化二砷是地鼠肺的弱致癌剂。 Rudnaietal用三氧化二砷处理小鼠,一年后有63%的小鼠发生肺癌,而对照组只有18%发生肺癌(16)。 Oswaldetal在瑞士雌鼠孕期皮下注射砷化合物,可使母鼠及其后代的淋巴细胞白血病和恶性淋巴瘤的发生率提高;如果仔鼠出生后继续注射砷化合物,可使这些肿瘤的发生率继续提高(14,16)。
3.3砷诱发细胞恶性转化的研究
Landolph(1989)发现,砷、镍、铬盐可诱发小鼠胚胎细胞C3H/10T1/2发生恶性转化,且这些转化后的细胞可在软琼脂糖内生长,并可接种在裸鼠形成肿瘤(32)。然而,在可诱发细胞恶性转化的砷、镍、铬盐的浓度下,却不能诱发该细胞发生毒毛旋花苷抗性突变,表明这些金属诱发细胞恶性转化不是通过碱基置换突变,也不是通过移码或缺失突变所致。他还发现,这些肿瘤的金属盐还可诱发人二倍体成纤维细胞发生安抗非依赖性转化,并认为导致恶性和安抗非依赖性转化的机制可能是由于这些金属盐可使细胞原癌基因重排或扩增,也可能是使癌基因抑制因子失活所致。
砷致癌的分子机制研究进展
近一个世纪以来,人们已经认识无机砷的各种致癌效应,主要是皮肤癌和肺癌。最近的流行病学研究也报道了无机砷的摄入与诱发肝、肾、膀胱和其它器官的癌症有关[1]。尽管砷作为人类致癌物已被广泛认可,但是迄今为止还没有一个被广泛认可、具有一定说服力并且符合砷生物效应的致癌机制。目前研究已深入至分子水平,包括砷致DNA甲基化模式改变、致免疫抑制、激活信号调控系统以及砷在代谢过程中产生活性氧自由基致DNA损伤的研究,对于从分子水平揭示砷的致癌机制具有极其重要的意义。
一、致DNA甲基化模式的改变
砷化合物进入体内,一般认为在肝脏甲基转移酶(MTase)作用下,以腺苷蛋氨酸(SAM)为甲基供体,甲基化为一甲基胂化物(MMA)和二甲基胂化物(DMA)。因为砷的生物转化途径涉及维持DNA甲基化的调节,即通过从SAM把甲基基团供给胞嘧啶,从而在DNA中生成5 甲基胞嘧啶(5 Mec)。已知许多基因表达的调控是受胞嘧啶的甲基化程度来控制的,经常是发生在胞嘧啶富集的CpG岛上,尤其是5′控制区(启动子部位),5 Mec可能改变转录因子与DNA的结合,继而在基因表达水平进行调节。在一些癌瘤的病原学中已证实p53抑癌基因的突变如皮肤癌、肺癌和膀胱癌,这些组织也是砷作用的靶组织。
Mass等[2]通过定量PCR HpaⅡ位点抑制,分析了A549细胞两个CCGG位点甲基化情况,利用亚硫酸氢盐的DNA测序法来显示5 Mec,结果暴露于0.08μmol/L～2μmol/L亚砷酸钠或30μmol/L～300μmol/L的砷酸钠,在p53基因启动子片段的341个碱基对内产生具有明显剂量反应关系的高度甲基化,而2μmol/L～2000μmol/L的DMA却无此作用,但当时并不清楚p53基因甲基化的改变是否会偶联p53基因表达的改变。
最近,Salazer等[3]检验了不同浓度亚砷酸钠诱导抑癌基因p53表达的能力,免疫印迹分析显示,Jurkat细胞、HeLa和LCL EBV细胞分别在1μmol/L和10μmol/L亚砷酸钠作用下,观察到诱导p53蛋白的表达。另外,Mass[2]在其实验中还发现A549细胞暴露于2μmol/L亚砷酸盐2周,整个基因组5 Mec含量也有所上升,大约是对照组的2倍,证明胞嘧啶甲基化模式的改变并不只限于p53基因,并且提出抑癌基因、癌基因或其它关键基因胞嘧啶甲基化模式的改变导致表达的改变,可能是砷致癌的一个机制。
另一方面,砷通过甲基化解毒这一过程消耗SAM。事实上,DNA甲基转移酶(MeTase)也需要同样的甲基供体,因此砷致癌作用中甲基化起重要作用。 Zhao等[4]报道,砷诱发的起始反应DNA低度甲基化是由于甲基的不断缺乏引起。这个假说首先被大鼠肝上皮细胞慢性暴露于低水平砷而被诱发转化所证实,并且进一步证实将该细胞接种于裸鼠发展为恶性肿瘤。整个基因组低度甲基化与恶性转化与SAM水平降低同时发生。砷诱发DNA低度甲基化是剂量和暴露持续时间的函数,并且当没有砷存在时这一现象仍然存在。在转化细胞中发现被DNA甲基化调控的金属硫蛋白(MT)基因高度表达。急性或不导致细胞转化的砷浓度不诱发整个基因组DNA低度甲基化,然而DNAMeTase转录增加,MeTase酶活性随着砷的甲基化而降低。
p53基因是当前最为引人注目的抑癌基因。p53蛋白主要功能涉及基因转录激活、监视DNA合成、修复和基因组可塑性、调节细胞稳态、抑制细胞生长、介导程序化细胞死亡,如此的生化机能是以p53为主的一组蛋白共同完成的。p53失活可导致p21WAF表达下降,p21对细胞周期素依赖性激酶抑制作用解除,也可引起pRb的磷酸化。后者使p16转录增加,因此p16与p53、pRb共处于细胞增殖的一个负性调节通路上。p16抑癌基因表达还由于胞嘧啶甲基化而被抑制,由于CpG岛位于p16启动子部位,过度甲基化导致p16的转录抑制。最近,Maesawa等[5]报道了p16基因甲基化现象,认为甲基化和缺失突变同样是p16基因的灭活机制。
p16的抑癌作用在于它抑制了细胞G1 S期转变过程中起关键作用的CDK4的功能。如清除p16的抑制作用,pRb持续磷酸化,可导致细胞在G1期未充分发育的细胞过度增殖,提前进入S期,导致突变的发生。目前关于p16基因在砷致癌性中的作用报道很少,随着检测方法的不断发展,不仅能利用South ern印迹杂交、FISH和多重PCR在DNA水平上对p16进行检测,还可以利用免疫组化检测出由于p16启动子点突变或CpG岛过度甲基化所致转录性抑制所引起的p16失活。近两年来,许多研究更进一步证实了p16在细胞增殖调控中的重要作用。因此,在今后的砷致癌性机制研究中进一步探讨p16基因的作用是十分必要的。
根据DNA甲基化模式改变和基因表达改变建立起的砷致癌模式[2]如下。
第一途径:假设砷是酶抑制剂,选择性或部分抑制一些依赖于SAM的MTase酶,从而降低了SAM的利用,由于SAM利用减少,则酶底物浓度增加,使那些未被抑制的MTase酶过度甲基化其底物。 在这些情况下,胞嘧啶MTase将产生大量5 Mec,结果导致DNA高度甲基化,可能抑制如p53、p16等某些维持细胞正常表型所必需的抑癌基因的表达,这样细胞获得生长优势,一旦细胞失去控制就会迅速繁殖; 另外,DNA高度甲基化还可抑制抑癌基因的细胞周期关卡(check point)功能,导致某些突变事件积累。因为胞嘧啶高度甲基化使细胞易诱发新的突变事件,5 Mec比胞嘧啶更易于脱氨基,产生C→T转换,从而引起染色体的不稳定性,导致突变及癌症的发生。在一些肿瘤组织中已注意到,伴随着SAM浓度上升,DNA高度甲基化,胞嘧啶甲基转移酶活性增高[6]。
第二途径:假设亚砷酸盐MTase消耗甲基基团,从而使SAM甲基供体池缺乏,甲基基团的缺乏将导致无力适当维持DNA胞嘧啶的甲基化,结果导致DNA低度甲基化,使某些基因可能是癌基因表达增加而致癌;DNA低度甲基化,降低蛋白质对DNA疏基基团的结合能力,而使DNA脆性增大,导致基因组不稳定,这种不稳定的基因组本身可能就作为启动或促进致癌的刺激物。
在这种情况下,砷通过甲基化的所谓解毒将导致肿瘤,而不再是一个保护机制。但是,必须强调指出的是,以上这两种途径在致癌过程中可能同时发生,也可能相互竞争。虽然,在Mass等[2]的研究中亚砷酸盐的暴露与p53高度甲基化有关,并且亚砷酸盐作用使基因组DNA也有较高的高度甲基化作用,这仅仅是砷暴露的一个可能结果。根据SAM和依赖于SAM的MTase相互作用,认为砷在致癌过程中可以改变一些起重要作用的基因的DNA甲基化模式。
二、代谢过程中产生自由基所致DNA损伤 Wang等[7]用中国仓鼠卵巢细胞CHO K1研究了亚砷酸盐诱导细胞死亡的特征,利用流式细胞仪分析细胞DNA含量分布,结果显示典型的凋亡细胞群,其DNA含量低于G1期细胞,40μmol/L亚砷酸盐处理后4小时测量,则未观察到具有明显亚G1期DNA含量的细胞。 然而,随着砷处理后培养时间的延长,亚G1期细胞不断上升,可观察到上升开始于亚砷酸盐处理后8小时,而通过2′,7′ 二氯荧光素的荧光强度而知,细胞内过氧化物水平在砷处理后4小时立即上升。如果在亚砷酸盐处理的同时加入抗氧化剂、铜离子络合剂、蛋白酶抑制剂或蛋白质合成抑制剂可减少亚G1期细胞数和核小体间DNA降解;如果在亚砷酸盐处理后给予上述物质也能有效地减少凋亡细胞。作者认为,砷诱导CHO K1细胞凋亡是由反应中产生的H2O2控制的,然后是铜离子介导的Fenton反应,该反应催化产生羟自由基(·OH),·OH通过生物大分子的重新合成选择性激活蛋白激酶。
Mass等[2]的研究在2000μmol/L的DMA未观察到HpaⅡ敏感性的上升。因为DMA已经被甲基化,不可能作为砷MTase的底物和(或)因为它不能与疏基基团反应而抑制酶活性。故认为DMA的作用机制不同于亚砷酸盐和砷酸盐,已有报道无机砷化物在体外可诱导鼠巨噬细胞氧化反应,另外有关小鼠动物模型也显示,口服DMA可诱发产生活性氧。 Yamanaka等[8,9]在这方面做了许多工作,利用电子自旋共振(ESR)技术证明DNA损伤是由于二甲基胂酸(DMAA)进一步代谢过程中通过与氧分子反应形成二甲基胂过氧化氢自由基造成的。
二甲基胂过氧化氢自由基与鸟嘌呤亲核亲电子位点结合形成DNA加全物,而因暴露于5μmol/L～100μmol/LDMA早期至少在AP位点形成以前激活L 132细胞涉及DNA聚合酶α的DNA修复系统,通过DNA糖基酶作用切除损伤碱基,DNA糖基酶水解N 糖基键在DNA中形成AP位点,含有AP位点的脱氧核糖部分乙醛基团部位发生β 脱除后产生DNA单链断裂,进一步通过脱氧核糖的乙醛基团和核蛋白的氨基基团之间的Schiff碱基反应而产生DNA蛋白交联。
无论是通过代谢过程中产生的·OH自由基激活蛋白激酶还是利用二甲基胂过氧化氢自由基造成DNA单链断裂和DNA蛋白质交联,都将为进一步探讨砷作用机制提供依据。
三、免疫抑制
近来的研究指出无机砷可诱发异常炎性反应样免疫毒性,认为免疫系统的异常改变是由于无机砷的毒性和致癌性所致。1995年GuhaMazumder首次报道印度Bengal西部在饮用无机砷污染井水的慢性砷中毒病人和有皮肤损伤的病人中,70%以上发现了肝大和(或)脾大的严重炎性反应。Germolec等[10]也报道,无机砷可诱发人类表皮角化细胞分泌细胞生成促进因子和生成因子,并且认为这一反应可能在无机砷致皮肤癌中起重要作用。
作者在另一篇文章中报道,人类表皮角化细胞与亚砷酸盐共同培养时可诱发角化细胞生长因子(GM CSF、TGF α、TNF α)释放并使mRNA转录水平升高,且观察到细胞繁殖标志:细胞总数c myc基因表达上升及3HTdR掺入增加[11]。Sakurai[12]利用鼠巨噬细胞在体外研究甲基胂化物———MAA、DMAA和TMAO(DMAA进一步甲基化的产物,三甲基胂氧化物)和无机砷化物———亚砷酸盐和砷酸盐的细胞毒性效应。无机砷对巨噬细胞有很强的细胞毒性,使细胞生存率比对照组下降50%(IC50)的浓度分别为5μmol/L(亚砷酸盐)或500μmol/L(砷酸盐),这些无机砷化物主要导致细胞坏死(80%)和部分细胞凋亡(20%),并且在细胞毒性剂量范围内明显诱发炎性细胞因子的释放。因为加入一些如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶和谷胱甘肽(GSH)等抗氧化剂或白细胞介素 1β转化酶(ICE)肽抑制剂可以抑制无机砷的强烈细胞毒性,所以认为无机砷的细胞毒性作用是通过活性氧和蛋白酶的激活来介导的。
无机砷的这些免疫毒性效应很有可能引起免疫抑制和炎性反应,并且很可能是引起每天饮用砷污染井水的慢性砷中毒病人致癌性和肝大、脾大等严重炎性反应的关键环节。相反,甲基胂化物的细胞毒性远低于无机砷,DMAA的IC50为5mmol/L,MAA和TMAO甚至在超过10mmol/L时也无毒性。另外,这些甲基胂化物抑制巨噬细胞释放TNF α。通过细胞形态学观察,DMA主要诱发巨噬细胞凋亡。DMAA的细胞毒性可能不同于无机砷的细胞毒性的机制,因为SOD、过氧化氢酶和ICE抑制剂对DMAA引起的细胞毒性无影响。相反,GSH可以加强DMAA的毒性。这些资料表明,哺乳动物细胞中砷甲基化在抑制由于无机砷所致的严重的免疫抑制和炎性反应中起着十分重要的作用,并且慢性砷中毒很有可能是体内不能被甲基化的砷化合物积累所致[13]。
四、激活细胞间信号传导 系统据报道,亚砷酸盐能明显诱导Ratl和PC12细胞间信号调控激酶(ERK)活性[15],这个激活过程依赖于ras并且对生长因子受体毒物苏拉明敏感。故认为亚砷酸盐可能早期作用于这个信号调控通路,即包括直接作用于生长因子受体,又可能在这些事件中激活生长因子受体[14],并且假设亚砷酸信号是通过生长因子受体型酪氨酸激酶介导的通路来传递的。为了鉴别上游信号级联反应的可能介质,Chen等[15]研究了暴露于亚砷酸盐的细胞中酪氨酸磷酸化情况。亚砷酸盐处理后迅速刺激细胞中一些蛋白质中的酪氨酸以非依赖于ras的方式磷酸化,这与对表皮生长因子(EGF)作用后的反应相似。
在这些磷酸化蛋白质中有3种含Shc原癌基因蛋白的异构体和EFG受体(EGFR)。Shc酪氨酸磷酸化能增强被联合免疫沉淀实验所证实的Shc和Grb2之间的相互作用,亚砷酸盐诱导Shc的酪氨酸磷酸化,增强Shc和Grb2之间的相互作用并且激活ERK。当然由于不同细胞株或种属之间EGFR含量的差异,也有得到阴性结果的报道[16]。 以上这些反应都奇迹般地被一般的生长因子受体毒物苏拉明或EGFR选择性抑制剂typhostinAG1478完全抑制。由于EGF的预处理EGFR表达的下游调控效应也衰减对亚砷酸盐处理所引起的ERK激活和Shc酪氨酸磷酸化的反应。
亚砷酸盐激活EGFR的机制至少有两种可能性存在[15]:①抑制涉及EGFR酪氨酸激酶灭活的酪氨酸磷酸化酶。此途径假设细胞显示明显的自发酪氨酸激酶活性,正常情况下,酪氨酸激酶的活性由蛋白质酪氨酸磷酸化酶来维持,酪氨酸磷酸化酶可以灭活激酶。Knebel等[17]的研究已经提供了强有力的证据,辐射、氧化剂和烷化剂就是通过此途径发挥作用的。酪氨酸磷酸化酶上的重要疏基基团已被假定为这些负性物质作用的靶,但是涉及的特异性磷酸化酶还未被证实。由于亚砷酸盐对邻近二疏基基团的高度反应性[17],也可能产生上述作用导致EGFR酪氨酸激酶活性上升。
②直接作用于受体固有的EGFR酪氨酸激酶活性的上游调控。亚砷酸盐能实际模拟配体作用而激活受体型酪氨酸激酶。EGFR具有富含半胱氨酸区域,这一区域对于调节配体的二聚合作用十分重要。在这些区域内,通过邻近二疏基基团的反应,亚砷酸盐可能改变EGFR的结构,导致EGFR固有的酪氨酸激酶活性上升。Chen等[15]观察到利用亚砷酸盐和酪氨酸磷酸化酶抑制剂原钒酸盐联合作用可以协同增强蛋白质酪氨酸磷酸化的结果,也支持第二个可能性。
EGFR在介导亚砷酸盐致癌效应中的可能作用引起人们的兴趣。符合亚砷酸盐促进肿瘤发生特性的还有亚砷酸盐处理增加DNA合成并且诱导细胞繁殖相关的c fos和c jun基因,对c fos的诱导作用几乎完全被typhostinAG1478抑制,则强调了EGFR在介导这个反应中的重要作用[15]。在许多人类肿瘤中报道过EGFR如neu、erbB 4等相关的酪氨酸激酶的异常激活[18]。在许多情况下也观察到Shc酪氨酸磷酸化[19]。 以上这些表明,EGFR和Shc介导了亚砷酸盐诱发的ras ERK信号级联反应,并且在亚砷酸盐致癌过程中很可能作为肿瘤促进剂影响这个生长因子信号通路。
综上所述,砷的致癌作用无疑是一个复杂过程,可能不适合于经典始动剂或肿瘤促进剂模型,也可能同时具有以上两种物质特性,砷改变DNA甲基化模型的能力,将使砷具有通过无突变而改变基因遗传信息方式的能力。因为DNA甲基模式的改变本身是可以遗传的。另外,某种类型DNA甲基化改变,显示易导致染色体的不稳定性,这与DNA损伤物质相一致,也与发展因子相一致。
砷代谢过程中产生的自由基造成DNA损伤也可能激活某些原癌基因或改变某些重要蛋白质功能,因此,对砷作用机制即砷能改变癌瘤有关基因的表达,以及与p53基因相关的上游调控和下游效应的分子作用网络及调控机制进一步研究,同时关注p53与其它抑癌基因的关系,了解并弄清这些基因的变异及其产物间的相互作用及对信号调控系统其它物质的作用,最终从基因水平探讨砷致癌机制,预测和防治砷相关肿瘤的发生,或从基因治疗的角度寻找治疗手段,或从蛋白质水平证实突变产物,这些都是今后需要研究的课题。
